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70 Mio. der Granulozyten wurden nach der Isolation in 700 µl RPMI 1640-Medium

suspendiert. Nach Zugabe von 50 µl [

H]-Inositol (entsprechend 50 µCi) wurde der Ansatz für

eine Stunde im CO

-Inkubator aufbewahrt. Anschließend wurde das nicht von den Granulozyten

inkorporierte [

H]-Inositol in 3 Zentrifugationsschritten mit PBS-Puffer ohne Calcium und

Magnesium (je 5 Min. bei 250 x g) abgewaschen. Die so vorbehandelten PMN wurden in 600

µl PBS-Puffer mit Calcium und Magnesium pro 10 Mio. Zellen aufgenommen und je 150 µl

dieser Suspension auf jedes Well gegeben. Zusätzlich wurde dem Ansatz 10 mM Lithiumchlorid

zugefügt. Nach 15 Minuten Inkubationszeit erfolgte die Stimulation mit 10 µM FMLP. Abge-

stoppt wurde die Reaktion mit je 1ml 15%iger Trichloressigsäure in einer Zeitreihe, nämlich nach

30 Sekunden, 1, 3, 5 und 10 Minuten. Der Probenüberstand wurde a/jointfilesconvert/444699/bgenommen und bei 10000

u/min für 3 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurden die Proben zur Abtrennung der

Lipidphase 3 mal mit je 2 ml Diethylether ausgeschüttelt.

Die Extraktion der Inositolphosphate erfolgte mit Hilfe der Ionen-

austausch-Chromatographie. Dazu wurden die mit Dowex-Ionenaustauscherharz gepackten

Chromatographiesäulen zunächst mit je 4 ml Ammoniumformiat konditioniert und mit je 5 ml

Aqua Dest. gewaschen. Nach Zugabe der Proben erfolgten Auswasch- und Reinigungsschritte

mit je 3 ml Myoinositol und je 5 ml Borax. Nun wurde mit je 4 ml Ammoniumformiat eluiert.

Die Proben wurden im Verhältnis 1:5 mit Szintillator durchmischt. Nach 2 Std. Ruhezeit für den

Szintillator wurde die Aktivität der Proben im ß-Counter gemessen.

2.2.9. Statistik

Alle Daten sind als Mittelwert  Standardfehler des Mittelwertes (SEM) angegeben. Die

statistische Signifikanz der Daten wurde mit dem gepaarten T-Test für normalverteilte Proben

ermittelt. Werte von p < 0,05 wurden als signifikant angesehen.

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