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Anschließend wurde mit 1 µM A 23187 pro Well stimuliert und der Versuchsansatz nach 15'

durch Kühlung der Platten auf Eis abgestoppt. Die Überstände der Wells wurden abpipettiert und

in Eppendorfcups gegeben, es folgte eine Zentrifugation bei 10000 U/min für 3 Minuten, um

Zellüberreste zu beseitigen. Vom Überstand wurden 100 µl für die Messung der Elastaseaktivität

abgenommen, die restlichen 900 µl wurden für die weiteren Messungen bei -20° C aufbewahrt.

2.2.4. Inhibition der Cyclooxygenase und der Phospholipase A

Die Inhibition der Cyclooxygenase wurde mit Acetysalicylsäure (Aspisol) vorgenom-

men. Diese wurde in einer Konzentration von 250 µM wahlweise gleichzeitig mit der Zugabe der

PMN oder vor der Fettsäureinkubation zu den HUVECs gegeben, was einer Einwirkzeit der

Acetylsalicylsäure von 30 bzw. 150 Minuten entspricht.

Die Hemmung der Phospholipase A

wurde mit AACOCF

durchgeführt, das durch

direkte Bindung an das Enzym seine inhibitorische Wirkung entfaltet (

). Zur Inhibition der

Endothelzellphospholipase A

wurde AACOCF

in einer Konzentration von 100 µM nach dem

Waschen der HUVECs und noch vor der Zugabe der freien Fettsäure auf die Wells gegeben. Die

weitere Vorgehensweise entsprach der oben beschriebenen Versuchsdurchführung.

2.2.5. Messung der Elastaseaktivität

Zur quantitativen Erfassung der Degranulationsreaktion der Granulozyten wurde die

Aktivität der Elastase, eines proteolytischen Enzyms, im Zellüberstand gemessen. Die Enzym-

aktivität wurde photometrisch bei 405 nm Wellenlänge bestimmt (Methode nach Kramps,

Meßzelle und Reagenzien wurden auf 37°C temperiert. Zur Messung wurden 100µl Probenvolu-

men mit 100µl Verdünnungspuffer und je 200µl Meßpuffer und chromogenes Substrat S-2484

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